Useimpien virusten genomiset sekvenssit on tunnettu.Nukleiinihappokoettimet, jotka ovat lyhyitä DNA-segmenttejä, jotka on suunniteltu hybridisoitumaan komplementaaristen virus-DNA- tai RNA-segmenttien kanssa.Polymeraasiketjureaktio (PCR) on tehokkaampi tekniikka virusten havaitsemiseen.Viime aikoina on kehitetty suuritehoisia diagnostisia menetelmiä.
A. Nukleiinihappohybridisaatiotekniikka
Nukleiinihappohybridisaatio, johon kuuluu pääasiassa Southern blotting (Southern) ja Northern blot (Northern), on nopeasti kehittyvä uusi tekniikka virusdiagnostiikan alalla.Hybridisaatiomäärityksen perusteena on käyttää lyhyitä DNA-segmenttejä (kutsutaan "koettimeksi"), jotka on suunniteltu hybridisoitumaan komplementaaristen virus-DNA- tai RNA-segmenttien kanssa.Kuumentamalla tai alkalisella käsittelyllä kaksijuosteinen kohde-DNA tai RNA erotetaan yksittäisiksi juosteiksi ja immobilisoidaan sitten kiinteälle alustalle.Tämän jälkeen koetin lisätään ja hybridisoidaan kohde-DNA:n tai RNA:n kanssa.Koska koetin on leimattu isotoopilla tai ei-radioaktiivisella nuklidilla, kohde-DNA tai RNA voidaan havaita autoradiografialla tai biotiini-avidiinijärjestelmällä.Koska suurin osa virusgenomeista on kloonattu ja sekvensoitu, ne voidaan havaita käyttämällä virusspesifisiä sekvenssejä koettimina näytteessä.Tällä hetkellä hybridisaatiomenetelmiin kuuluvat: dot blot, in situ -hybridisaatio soluissa, DNA blotting (DNA) (Southern blot) ja RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR-tekniikka
Viime vuosina on kehitetty sarja PCR:ään perustuvia in vitro nukleiinihapon monistustekniikoita epäherkkien tai viljelemättömien virusten testaamiseksi.PCR on menetelmä, jolla voidaan syntetisoida spesifinen DNA-sekvenssi in vitro -polymeraasireaktiolla.PCR-prosessi sisältää lämpösyklin, jossa on kolme vaihetta: denaturaatio, pariutuminen ja pidentäminen Korkeassa lämpötilassa (93 ℃ ~ 95 ℃) kaksijuosteinen DNA erotetaan kahdeksi yksittäiseksi DNA-juosteeksi;sitten alhaisessa lämpötilassa (37-60 °C) kaksi syntetisoitua nukleotidialuketta pariutuvat komplementaarisiin DNA-segmentteihin;kun taas Taq-entsyymille sopivassa lämpötilassa (72℃) uusien DNA-ketjujen synteesi alkaa alukkeen 3'-päästä käyttäen komplementaarista DNA:ta templaatteina ja yksittäisiä nukleotideja materiaaleina.Joten jokaisen syklin jälkeen yksi DNA-ketju voidaan monistaa kahdeksi ketjuksi.Toistamalla tämä prosessi, jokaista yhdessä syklissä syntetisoitua DNA-ketjua voidaan käyttää templaattina seuraavassa syklissä, ja DNA-ketjujen määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä, mikä tarkoittaa, että PCR:n tuotanto monistuu 2n log nopeudella.25-30 syklin jälkeen PCR:n tuotanto tunnistetaan elektroforeesilla, ja spesifisiä DNA-tuotteita voidaan tarkkailla UV-valossa (254 nm).Sen spesifisyyden, herkkyyden ja mukavuuden vuoksi PCR on otettu käyttöön monien virusinfektioiden, kuten HCV:n, HIV:n, CMV:n ja HPV:n, kliinisessä diagnosoinnissa.Koska PCR on erittäin herkkä, se voi havaita viruksen DNA:ta fg-tasolla, toimenpide tulee suorittaa erittäin huolellisesti väärien positiivisten tulosten välttämiseksi.Lisäksi positiivinen tulos nukleiinihappotestissä ei tarkoita, että näytteessä olisi elävää tarttuvaa virusta.
PCR-tekniikan laajalla soveltamisella kehitetään uusia PCR-tekniikkaan perustuvia tekniikoita ja menetelmiä erilaisiin testitarkoituksiin.Esimerkiksi reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR voi havaita viruskuorman;in situ PCR:ää käytetään virusinfektion tunnistamiseen kudoksessa tai soluissa;Sisäkkäinen PCR voi lisätä PCR:n spesifisyyttä.Niiden joukossa reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää on kehitetty nopeammin.Monet uudet tekniikat, kuten TaqMan-hydrolyysikoetin, hybridisaatiokoetin ja molekyylimajakkakoetin, on yhdistetty reaaliaikaiseksi kvantitatiiviseksi PCR-tekniikaksi, jota käytetään laajasti kliinisessä tutkimuksessa.Potilaiden kehon nesteen viruskuorman tarkan tunnistamisen lisäksi tätä menetelmää voidaan käyttää myös lääkettä sietävän mutantin havaitsemiseen.Siksi reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää käytetään pääasiassa parantavan vaikutuksen arvioinnissa ja lääketoleranssin seurannassa.
C. Viruksen nukleiinihappojen korkean suorituskyvyn havaitseminen
Uusien ilmaantuvien tartuntatautien nopean diagnosoinnin tarpeiden täyttämiseksi on luotu erilaisia korkean suorituskyvyn havaitsemismenetelmiä, kuten DNA-siruja (DNA).DNA-siruja varten syntetisoidaan spesifisiä koettimia ja kiinnitetään pieniin piisiruihin erittäin suurella tiheydellä DNA-koettimen mikrosirujen (DNA) muodostamiseksi, joka voidaan hybridisoida näytteen kanssa.Hybridisaatiosignaali voidaan kuvata konfokaalimikroskoopilla tai laserskannerilla ja käsitellä edelleen tietokoneella, jolloin saadaan valtava tietojoukko eri geeneistä.DNA-siruja on kahdenlaisia."Synteesisiru" on seuraava: spesifiset oligonukleotidit syntetisoidaan suoraan siruille.Toinen on DNA pool-siru.Kloonatut geenit tai PCR-tuotteet painetaan järjestyksessä dialle.DNA-siruteknologian etuna on valtavan määrän DNA-sekvenssien samanaikainen havaitseminen.Patogeenien havaitsemissirun uusin versio pystyy tunnistamaan yli 1700 ihmisen virusta kerralla.DNA-siruteknologia ratkaisi perinteisten nukleiinihappojen hybridisaatiomenetelmien ongelmat ja sillä on erittäin laajat sovellukset virusdiagnostiikkaan ja epidemiologiseen tutkimukseen.
Postitusaika: 23.12.2020